蛋白质结构预测：AlphaFold🔗

关键词： AlphaFold2, AlphaFold3, 蛋白质结构预测, CASP, ColabFold, pLDDT, PAE
难度： ⭐⭐⭐
预计阅读时间： 45 分钟
最后更新： 2026-04-08

本章导读🔗

蛋白质的三维结构决定了其功能，长期以来，获取蛋白质结构主要依赖 X-ray 晶体学、冷冻电镜（Cryo-EM）和核磁共振（NMR）等实验方法——这些方法耗时长、成本高，且并非对所有蛋白质都适用。2020 年，DeepMind 开发的 AlphaFold2 在 CASP14 竞赛中取得了革命性突破，将蛋白质结构预测的精度提升到接近实验水平，彻底改变了结构生物学的研究范式。

读完本章，你将能够：

1. 理解 AlphaFold 的核心原理和置信度指标
2. 使用 AlphaFold 数据库查询已有预测结构
3. 通过 ColabFold 在线预测自己感兴趣的蛋白质结构
4. 了解 AlphaFold3 的新功能和使用方法
5. 正确解读和评估预测结果的可靠性

本章内容适合有生物学基础但无深度学习背景的研究生，重点在实操而非数学推导。

1. AlphaFold 简介与原理🔗

1.1 CASP 竞赛与 AlphaFold 的诞生🔗

CASP（Critical Assessment of protein Structure Prediction）是蛋白质结构预测领域最权威的国际双年竞赛，自 1994 年创办以来已举办多届。竞赛的核心规则是：组委会提供一组尚未公开解析结构的蛋白质序列，参赛团队在限定时间内提交结构预测，最终以实验解析结构为标准进行评估。

评估使用的核心指标是 GDT-TS（Global Distance Test - Total Score），满分 100 分，一般认为 GDT-TS > 90 即达到实验级别精度。

关键里程碑：

AlphaFold2 在 CASP14 中的表现被《Nature》称为"解决了蛋白质折叠问题的 50 年挑战"。其预测精度在大多数目标蛋白上已经达到甚至超过实验误差范围。

1.2 AlphaFold2 核心架构（概念理解）🔗

AlphaFold2 的架构可以概括为两大核心模块，你不需要理解所有技术细节，但需要知道它们各自的作用：

Evoformer 模块（进化信息处理器）🔗

Evoformer 是 AlphaFold2 的"大脑"，它的核心任务是从进化信息中提取结构信号。

• 输入：多序列比对（MSA）和残基对（pair）信息
• 作用：通过多层注意力机制（类似于 Transformer），让序列中的每个位置"看到"其他位置的信息，从而捕获残基之间的共进化关系（co-evolution）
• 直觉理解：如果蛋白质序列中两个位置在进化过程中总是"协同突变"，说明它们在空间上很可能靠近——Evoformer 就是在学习这种模式
• Evoformer 堆叠 48 层，逐层精炼对蛋白质的理解

Structure Module（结构生成器）🔗

Structure Module 将 Evoformer 输出的抽象信息转化为实际的 3D 坐标。

• 输入：Evoformer 处理后的残基对表示
• 输出：每个残基的 3D 坐标（骨架原子 + 侧链原子）
• 核心操作：通过迭代优化（recycling），反复精炼预测的结构，通常循环 3 次
• 直觉理解：类似于雕塑家先画出草图，再反复修改，每次更接近最终作品

整体流程简图🔗

氨基酸序列
    ↓
[MSA 搜索] → 多序列比对（找到同源序列）
    ↓
[模板搜索] → 已知同源结构（可选）
    ↓
[Evoformer × 48 层] → 残基对表示 + 序列表示
    ↓
[Structure Module × 3 次循环] → 3D 原子坐标
    ↓
[Amber 力场松弛] → 最终预测结构（PDB 文件）

1.3 MSA（多序列比对）的核心作用🔗

MSA 是 AlphaFold2 中最关键的输入之一。

什么是 MSA？

MSA（Multiple Sequence Alignment）是将目标蛋白质序列与数据库中的同源序列进行比对，找到"亲戚"序列的过程。这些同源序列来自不同物种的同一蛋白质家族。

为什么 MSA 如此重要？

• 共进化信号：如果两个氨基酸位置在空间上接触，当其中一个发生突变时，另一个往往也需要相应突变以维持结构稳定。MSA 中包含了大量这样的共进化信息
• 保守性分析：高度保守的位置通常是功能性关键位点或结构核心
• MSA 深度：同源序列数量越多（即 MSA 深度越大），预测通常越准确

实际影响：

提示： 这也是"孤儿蛋白"（orphan proteins，几乎没有同源序列的蛋白质）预测困难的主要原因。对于 MSA 稀疏的蛋白质，可以考虑使用 ESMFold 等不依赖 MSA 的方法。

1.4 核心置信度指标详解🔗

AlphaFold 提供了多个置信度指标来帮助你评估预测的可靠性。正确理解这些指标对于避免错误使用预测结构至关重要。

pLDDT（predicted Local Distance Difference Test）🔗

pLDDT 是逐残基的置信度分数，范围 0-100，反映模型对每个残基局部结构的自信程度。

⚠️ 重要： pLDDT < 50 的区域通常代表固有无序区域（Intrinsically Disordered Regions, IDR），这些区域在实际细胞中并没有固定的三维结构。AlphaFold 给出的低 pLDDT 区域不代表预测失败，而恰恰表明模型正确识别了这些区域的无序性质。不要试图分析这些区域的空间构象。

PAE（Predicted Aligned Error）🔗

PAE 是一个残基对（pairwise）级别的指标，描述的是"如果以残基 x 的位置为参考对齐结构，残基 y 的位置误差有多大"。

• 单位：Å（埃）
• 范围：0-30+ Å
• 呈现方式：NxN 二维热图（N = 残基数），颜色越深（蓝色）表示误差越小
• 核心作用：评估domain 之间的相对位置关系是否可靠

PAE 热图解读技巧：

      Domain A    Domain B
       ┌────────┬────────┐
Domain │ 深蓝   │ 浅色   │  ← 对角块深蓝说明 domain 内部结构可靠
A      │ (低PAE)│(高PAE) │  ← 非对角块浅色说明两个 domain 相对位置不确定
       ├────────┼────────┤
Domain │ 浅色   │ 深蓝   │
B      │(高PAE) │(低PAE) │
       └────────┴────────┘

• 对角线上的深蓝色方块：对应各个 domain 内部结构可靠
• 非对角线区域颜色浅：两个 domain 的相对朝向不确定（即使各自内部结构准确，它们之间的空间关系可能不可靠）
• 全图深蓝：整体结构（包括 domain 间的相对关系）都可靠

典型场景： 一个蛋白质有两个 domain 通过柔性 linker 连接——PAE 图上会看到两个深蓝色块（各自 domain 内部可靠），但块之间颜色浅（linker 两侧的相对位置不确定）。

pTM 和 ipTM🔗

• pTM（predicted TM-score）：整体结构质量的全局指标，范围 0-1
• pTM > 0.5：整体折叠基本正确
• pTM > 0.8：高置信度预测
• ipTM（interface predicted TM-score）：仅用于多聚体/复合物预测，评估蛋白质-蛋白质界面的预测质量
• ipTM > 0.8：界面预测非常可靠
• ipTM 0.6-0.8：界面可能存在，但细节不确定
• ipTM < 0.6：界面预测不可靠

实用建议： 使用 AlphaFold 预测结构时，同时查看 pLDDT、PAE 和 pTM，不要只看某一个指标。结构质量的评估需要综合判断。

2. AlphaFold2 实操🔗

2.1 AlphaFold 蛋白质结构数据库（AFDB）🔗

AlphaFold Protein Structure Database（AFDB）是 DeepMind 与 EMBL-EBI 合作建立的预测结构数据库，包含超过 2 亿个蛋白质的预测结构。

访问地址： https://alphafold.ebi.ac.uk/

使用方法：

1. 通过 UniProt ID 搜索（推荐）：
2. 在搜索框中输入 UniProt Accession（如 P00520）或蛋白质名称

3. 点击搜索结果进入详情页

4. 详情页信息解读：

5. 3D 结构查看器：彩色编码对应 pLDDT 值（深蓝 > 90, 浅蓝 70-90, 黄 50-70, 橙 < 50）
6. 序列区域颜色条：快速定位高/低置信度区域

7. PAE 图：点击 "Predicted Aligned Error" 标签查看

8. 下载预测结构：

9. PDB 格式：https://alphafold.ebi.ac.uk/files/AF-{UniProtID}-F1-model_v4.pdb
10. mmCIF 格式：https://alphafold.ebi.ac.uk/files/AF-{UniProtID}-F1-model_v4.cif
11. PAE JSON：https://alphafold.ebi.ac.uk/files/AF-{UniProtID}-F1-predicted_aligned_error_v4.json

批量下载示例（命令行）：

# 下载单个蛋白质结构（以人源 p53 蛋白为例，UniProt ID: P04637）
wget https://alphafold.ebi.ac.uk/files/AF-P04637-F1-model_v4.pdb

# 批量下载多个蛋白质（将 UniProt ID 存入文件）
cat uniprot_ids.txt | while read id; do
    wget -q "https://alphafold.ebi.ac.uk/files/AF-${id}-F1-model_v4.pdb"
    sleep 1  # 避免请求过快
done

通过 Python 访问（REST API）：

import requests

def download_af_structure(uniprot_id, output_dir="."):
    """从 AFDB 下载预测结构"""
    url = f"https://alphafold.ebi.ac.uk/files/AF-{uniprot_id}-F1-model_v4.pdb"
    response = requests.get(url)
    if response.status_code == 200:
        filepath = f"{output_dir}/AF-{uniprot_id}.pdb"
        with open(filepath, 'w') as f:
            f.write(response.text)
        print(f"✓ 下载成功: {filepath}")
    else:
        print(f"✗ 下载失败: {uniprot_id} (HTTP {response.status_code})")

# 使用示例
download_af_structure("P04637")  # 人源 p53

注意： AFDB 中的结构是用 AlphaFold2 预计算的，不能自定义参数。如果需要预测数据库中没有的蛋白质（如突变体、人工设计蛋白等），需要使用 ColabFold 或本地安装 AlphaFold2。

2.2 ColabFold：免费在线预测（推荐新手首选）🔗

ColabFold 是由 Sergey Ovchinnikov、Milot Mirdita 和 Martin Steinegger 等人开发的 AlphaFold2 快速实现方案，通过 Google Colab 免费提供 GPU 资源进行预测。

访问地址： https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb

为什么推荐 ColabFold？

ColabFold 使用步骤详解：

第一步：打开 Notebook

1. 访问 ColabFold 的 GitHub 页面：https://github.com/sokrypton/ColabFold
2. 点击 "AlphaFold2 using MMseqs2" 的 Colab 链接
3. 确保 Colab 的运行时设置为 GPU：运行时 → 更改运行时类型 → 选择 T4 GPU

第二步：输入序列

在 query_sequence 字段中粘贴你的蛋白质氨基酸序列（单字母编码，不含 FASTA 头部）：

MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSH
GSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKL
LSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR

核心参数说明：

第三步：运行预测

按顺序点击运行各代码单元（或使用 运行时 → 全部运行）。典型耗时：

• MSA 搜索：2-5 分钟
• 结构预测（5 个模型）：10-30 分钟（取决于蛋白质大小和 GPU 类型）

第四步：下载结果

预测完成后，结果会自动打包为 zip 文件并下载，包含：

{jobname}/
├── {jobname}_relaxed_rank_001_*.pdb    # 排名第一的松弛结构
├── {jobname}_unrelaxed_rank_001_*.pdb  # 排名第一的未松弛结构
├── {jobname}_unrelaxed_rank_002_*.pdb  # 排名第二...
├── ...
├── {jobname}_scores_rank_001_*.json    # 置信度分数
├── {jobname}_pae_rank_001_*.png        # PAE 热图
├── {jobname}_coverage.png              # MSA 覆盖图
├── {jobname}_plddt.png                 # pLDDT 折线图
└── log.txt                             # 运行日志

2.3 本地安装 AlphaFold2🔗

如果你需要大批量预测、定制化修改代码或不希望依赖外部服务，可以在本地服务器上安装 AlphaFold2。

硬件要求🔗

注意： 2.5 TB 的磁盘需求主要来自基因数据库（UniRef90, MGnify, BFD 等）的下载和解压。这是本地安装的最大障碍之一。

Docker 安装方式（推荐）🔗

# 1. 确保已安装 Docker 和 NVIDIA Container Toolkit
docker --version
nvidia-smi

# 2. 克隆 AlphaFold 仓库
git clone https://github.com/google-deepmind/alphafold.git
cd alphafold

# 3. 下载遗传数据库（约 2.5TB，需要数小时到数天）
# 使用官方提供的下载脚本
bash scripts/download_all_data.sh /path/to/data

# 数据库下载内容：
# - BFD (~1.7 TB)
# - MGnify (~120 GB)
# - PDB70 (~56 GB)
# - PDB mmCIF (~200 GB)
# - UniClust30 (~206 GB)
# - UniRef90 (~59 GB)
# - PDB seqres (~200 MB)

# 4. 构建 Docker 镜像
docker build -f docker/Dockerfile -t alphafold .

# 5. 运行预测
python docker/run_docker.py \
    --fasta_paths=input/my_protein.fasta \
    --max_template_date=2022-01-01 \
    --model_preset=monomer \
    --db_preset=full_dbs \
    --data_dir=/path/to/data \
    --output_dir=output/

关键参数说明🔗

# model_preset 选择：
# --model_preset=monomer         # 单体蛋白
# --model_preset=monomer_casp14  # 单体（CASP14 参数）
# --model_preset=monomer_ptm     # 单体（带 pTM 输出）
# --model_preset=multimer        # 多聚体蛋白

# db_preset 选择：
# --db_preset=full_dbs    # 完整数据库（推荐，更准确）
# --db_preset=reduced_dbs # 精简数据库（节省空间，约 500GB）

# max_template_date：模板截止日期
# 如果你想复现 CASP14 的结果，设为 2020-05-14
# 如果用于实际研究，设为当前日期即可

输入文件格式🔗

AlphaFold2 的输入是标准 FASTA 格式文件：

>my_protein
MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSH
GSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKL
LSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR

多聚体预测时，每条链用单独的 FASTA 条目表示：

>chain_A
MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSH
>chain_B
MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLST

2.4 结果解读详解🔗

pLDDT 分析🔗

预测完成后，首先查看 pLDDT 曲线图和 B-factor 列：

在 PyMOL 中按 pLDDT 着色：

# PyMOL 命令：按 B-factor（即 pLDDT）着色
load AF-P04637-F1-model_v4.pdb
spectrum b, red_yellow_green_cyan_blue, minimum=0, maximum=100

用 Python 提取 pLDDT 值：

from Bio.PDB import PDBParser

parser = PDBParser(QUIET=True)
structure = parser.get_structure("af_model", "ranked_0.pdb")

# pLDDT 存储在 B-factor 列中
for model in structure:
    for chain in model:
        for residue in chain:
            for atom in residue:
                if atom.name == "CA":  # 只看 Cα 原子
                    plddt = atom.bfactor
                    resid = residue.id[1]
                    resname = residue.resname
                    print(f"残基 {resid} ({resname}): pLDDT = {plddt:.1f}")

统计 pLDDT 分布：

import numpy as np
from Bio.PDB import PDBParser

parser = PDBParser(QUIET=True)
structure = parser.get_structure("model", "ranked_0.pdb")

plddts = []
for atom in structure.get_atoms():
    if atom.name == "CA":
        plddts.append(atom.bfactor)

plddts = np.array(plddts)
print(f"平均 pLDDT: {plddts.mean():.1f}")
print(f"pLDDT > 90 的残基比例: {(plddts > 90).mean()*100:.1f}%")
print(f"pLDDT > 70 的残基比例: {(plddts > 70).mean()*100:.1f}%")
print(f"pLDDT < 50 的残基比例: {(plddts < 50).mean()*100:.1f}%")

PAE 图可视化🔗

import json
import matplotlib.pyplot as plt
import numpy as np

# 加载 PAE 数据
with open("ranked_0_pae.json", "r") as f:
    pae_data = json.load(f)

# ColabFold 格式
if "pae" in pae_data:
    pae_matrix = np.array(pae_data["pae"])
# AFDB / 原版 AF2 格式
elif "predicted_aligned_error" in pae_data[0]:
    pae_matrix = np.array(pae_data[0]["predicted_aligned_error"])

# 绘图
plt.figure(figsize=(8, 7))
plt.imshow(pae_matrix, cmap="bwr", vmin=0, vmax=30)
plt.colorbar(label="Expected Position Error (Å)")
plt.xlabel("Scored Residue")
plt.ylabel("Aligned Residue")
plt.title("Predicted Aligned Error (PAE)")
plt.tight_layout()
plt.savefig("pae_plot.png", dpi=150)
plt.show()

多模型对比（Ranking）🔗

AlphaFold2 默认运行 5 个模型（model_1 到 model_5），结果按置信度排序：

• ranked_0.pdb：最佳模型（最高置信度）
• ranked_1.pdb：次佳模型
• ...

对比多个模型：

# PyMOL 中叠合所有模型：
load ranked_0.pdb, model_1
load ranked_1.pdb, model_2
load ranked_2.pdb, model_3
align model_2, model_1
align model_3, model_1
# 如果多个模型高度一致，说明预测结果稳健
# 如果某些区域差异大，说明该区域预测不确定

实用技巧： 如果 5 个模型在某个区域给出了不同的构象，那么该区域预测的可信度较低——即使某个单独模型的 pLDDT 可能不算太低。多模型一致性是判断可靠性的重要补充依据。

3. AlphaFold3🔗

3.1 AF3 的革命性进步🔗

AlphaFold3（2024 年 5 月发布于 Nature，2025 年已完全开源）相比 AF2 有重大升级：

核心新能力：

架构变化（概念层面）：

• AF2 的 Evoformer 被替换为 Pairformer（精简版的 pair representation 处理模块）
• Structure Module 被替换为 Diffusion Module（扩散模型），这是 AF3 能处理非蛋白质分子的关键
• 不再需要 MSA 逐步处理，改为单次 MSA embedding
• 输出不再是确定性的——AF3 每次运行可以生成不同的结构样本（采样性质）

3.2 AlphaFold Server 使用🔗

AlphaFold Server 是 DeepMind 提供的免费在线预测服务，底层运行 AlphaFold3。

访问地址： https://alphafoldserver.com/

使用步骤：

1. 注册/登录：使用 Google 账号登录
2. 创建任务（New Job）：
3. 输入蛋白质序列（支持多条链）
4. 添加配体（小分子：输入 SMILES 或 CCD code）
5. 添加核酸（DNA/RNA 序列）
6. 添加离子（如 Zn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺ 等）
7. 提交预测：点击 "Submit" 开始预测
8. 查看结果：通常 30 分钟到数小时出结果
9. 下载结构：获取 mmCIF 格式的预测结构和置信度信息

限制：

• 每天有预测次数限制（截至 2025 年约 10 次/天）
• 不能自定义模型参数
• 结果用于学术研究时需要遵守 DeepMind 的条款
• ⚠️ 不允许将结果用于药物设计等商业用途（需使用开源版本）

输入示例——蛋白质-小分子复合物：

Job Name: CDK2_inhibitor_complex

Entity 1 (Protein):
  Sequence: MENFQKVEKIGEGTYGVVYKARNKLTGEVVALKKIRLESEE...
  Copies: 1

Entity 2 (Ligand):
  CCD Code: ATP    # 或输入 SMILES
  Copies: 1

Entity 3 (Ion):
  Type: MG         # 镁离子
  Copies: 2

3.3 AF3 开源版本🔗

DeepMind 官方开源（2025 年）🔗

2025 年，DeepMind 将 AlphaFold3 的完整代码和模型权重开源。

GitHub 仓库： https://github.com/google-deepmind/alphafold3

# 安装 AF3（推荐使用 Docker）
git clone https://github.com/google-deepmind/alphafold3.git
cd alphafold3

# 申请模型权重（需要同意使用条款）
# 访问相关页面提交申请

# 构建 Docker 镜像
docker build -t alphafold3 -f docker/Dockerfile .

# 准备输入 JSON 文件（示例）
# input.json:
# {
#   "name": "test_prediction",
#   "modelSeeds": [1],
#   "sequences": [
#     {
#       "protein": {
#         "id": "A",
#         "sequence": "MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTK"
#       }
#     }
#   ]
# }

# 运行预测
python run_alphafold.py \
    --json_path=input.json \
    --model_dir=/path/to/models \
    --db_dir=/path/to/databases \
    --output_dir=output/

Protenix（字节跳动开源 AF3 复现）🔗

Protenix 是字节跳动（ByteDance）开源的 AlphaFold3 复现项目，2024 年底发布。

GitHub 仓库： https://github.com/bytedance/Protenix

特点：

• 完全独立实现的 AF3 架构
• 模型权重从头训练（不依赖 DeepMind 的权重）
• 宽松的开源许可证（Apache 2.0），可用于商业场景
• 提供在线预测服务：https://protenix.ai/
• 在多个 benchmark 上达到接近 AF3 官方的精度

# Protenix 安装
git clone https://github.com/bytedance/Protenix.git
cd Protenix
pip install -e .

# 运行预测（参考官方文档）
python inference.py \
    --input input.json \
    --output_dir output/ \
    --model_dir /path/to/weights

3.4 AF2 vs AF3 选择建议🔗

3.5 AF3 的局限性🔗

尽管 AF3 能力显著提升，以下局限需要注意：

1. 小分子结合位姿精度有限：AF3 的小分子对接精度（成功率约 ~60%，RMSD < 2Å）低于专门的分子对接工具（如 AutoDock Vina, Glide）。不建议直接用于药物筛选
2. 构象采样的随机性：AF3 基于扩散模型，每次运行结果可能不同。建议运行多次（如 5 个 seeds）取最佳结果
3. 共价配体和翻译后修饰支持有限：虽然名义上支持，但精度不稳定
4. 计算资源需求更高：AF3 比 AF2 需要更多 GPU 显存（推荐 A100 80GB）
5. 训练数据偏差：对 PDB 中稀有的复合物类型预测较差

4. ColabFold 详细教程🔗

4.1 Google Colab 环境说明🔗

ColabFold 运行在 Google Colab 上，使用前需了解：

• 免费版：提供 T4 GPU（16GB 显存），有使用时间限制（约 12 小时/次，可能被断连）
• Colab Pro（$9.99/月）：更长运行时间，V100 或 A100 GPU
• Colab Pro+（$49.99/月）：后台运行，终端模式

GPU 显存与蛋白质长度关系（ColabFold, T4 16GB）：

OOM 解决方案： 如果遇到 Out of Memory 错误，尝试以下方法： 1. 减少 num_models 为 1 或 3 2. 减少 num_recycles 为 1 3. 将蛋白质拆分为独立 domain 分别预测 4. 升级到 Colab Pro 使用 A100 GPU

4.2 MSA 模式选择🔗

ColabFold 提供多种 MSA 搜索策略：

MMseqs2 vs JackHMMER + HHblits（原版 AF2）：

• MMseqs2 比原版 MSA 搜索快 40-100 倍
• 精度略有差异：在绝大多数蛋白上结果一致，但在 MSA 稀疏的蛋白上原版可能略好
• ColabFold 的 MSA 搜索使用远程服务器（MMseqs2 API），不需要本地数据库

4.3 多聚体预测（Multimer）🔗

ColabFold 支持蛋白质多聚体预测（如二聚体、三聚体等）。

输入格式（在 Notebook 的 query_sequence 中）：

# 同源多聚体（如同源二聚体）：用冒号 ":" 分隔链
MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTK:MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTK

# 异源多聚体（A-B 异源二聚体）
MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTK:MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQR

多聚体预测注意事项：

1. ColabFold 多聚体使用的是 alphafold2_multimer_v3 模型
2. 链数越多，显存需求越大——两条 300 残基的链 ≈ 一条 600 残基的单体
3. 需要重点关注 ipTM 分数来评估界面可靠性
4. 预测结果的链间相对朝向可能不准确——用 PAE 图验证
5. 对于已知不互作的蛋白，AF2 也可能给出"看起来合理"的复合物结构，需要用 ipTM 和 PAE 来判断是否真正互作

判断蛋白质-蛋白质互作（PPI）的经验规则：

ipTM > 0.8 且链间 PAE < 10Å → 高置信度互作
ipTM 0.6-0.8：不确定，需要实验验证
ipTM < 0.6：很可能不互作或预测不可靠

4.4 模板（Template）使用🔗

模板是已知的同源蛋白质实验结构，可以辅助 AlphaFold2 的预测。

ColabFold 中的模板选项：

• template_mode = "none"：不使用模板（默认，推荐用于大多数情况）
• template_mode = "pdb70"：使用 PDB70 数据库中的模板
• template_mode = "custom"：使用用户提供的自定义模板

什么时候使用模板？

• 大多数情况下 不需要模板——AlphaFold2 自身已经足够准确
• 当 MSA 非常稀疏时，模板可能有帮助
• 当你有自己的实验结构（如某个突变体的晶体结构）想引导预测时
• 注意：如果模板错误或误导性较强，反而可能降低预测质量

4.5 ColabFold 本地版（LocalColabFold）🔗

如果 Google Colab 限制影响你的工作，可以在本地服务器安装 ColabFold：

# 安装 LocalColabFold（需要 Linux 服务器 + NVIDIA GPU）
# 方法一：使用 conda
conda create -n colabfold python=3.10
conda activate colabfold
pip install "colabfold[alphafold] @ git+https://github.com/sokrypton/ColabFold"

# 下载模型权重和数据库
python -m colabfold.download

# 运行预测
colabfold_batch input.fasta output_dir/

# 方法二：使用 Docker（更推荐）
docker pull ghcr.io/sokrypton/colabfold:latest
docker run --gpus all -v $(pwd):/work ghcr.io/sokrypton/colabfold \
    colabfold_batch /work/input.fasta /work/output/

colabfold_batch 常用参数：

colabfold_batch input.fasta output_dir/ \
    --num-recycle 3 \
    --num-models 5 \
    --amber \
    --templates \
    --num-seeds 1 \
    --zip

5. 常见问题与注意事项🔗

5.1 什么情况下预测不可靠？🔗

以下情况 AlphaFold 的预测精度可能显著下降：

5.2 多聚体预测进阶技巧🔗

1. 从小到大：先预测各亚基的单体结构（验证各自质量），再预测复合物
2. 增加 recycles：多聚体预测中 num_recycles=6 或更多可能改善结果
3. 多次采样：使用不同随机种子运行多次，选择 ipTM 最高的结果
4. 生物学先验：如果已知互作界面的大致区域，用来验证预测结果
5. 警惕假阳性：AF2 可能对任何输入的蛋白对都给出"复合物结构"——低 ipTM（< 0.6）的结果不代表蛋白质互作

5.3 如何验证预测结果🔗

与实验结构对比🔗

# 使用 PyMOL 叠合预测结构与实验结构
# PyMOL 命令
load predicted.pdb, pred
load experimental.pdb, exp
align pred, exp
# 查看 RMSD 值：
# RMSD < 1 Å：极佳
# RMSD 1-2 Å：很好
# RMSD 2-4 Å：可接受
# RMSD > 4 Å：差异较大

分子动力学（MD）验证🔗

将 AlphaFold 预测结构作为 MD 模拟的初始构象，运行短时间 MD（如 100 ns），观察：

• 结构是否稳定（RMSD 是否收敛）
• 关键相互作用是否维持
• 高 pLDDT 区域的 RMSF 是否较低（应该较低）

# GROMACS 简单 MD 流程（简化示意）
gmx pdb2gmx -f predicted.pdb -o processed.gro -water spce
gmx editconf -f processed.gro -o box.gro -c -d 1.0 -bt cubic
gmx solvate -cp box.gro -cs spc216.gro -o solvated.gro -p topol.top
# ... 后续步骤参见 MD 章节

MolProbity 验证🔗

MolProbity（https://molprobity.biochem.duke.edu/）可以检查结构的立体化学质量：

• Ramachandran outliers
• 侧链旋转异构体（rotamer）异常
• 原子碰撞（clashes）

注意： 如果你启用了 Amber 松弛（num_relax > 0），MolProbity 的各项指标通常会更好。未松弛的结构可能存在一些立体化学异常，但这不影响整体折叠的准确性。

5.4 引用规范🔗

使用 AlphaFold 相关工具时，请正确引用：

使用 AlphaFold2 预测结构：

Jumper, J. et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature 596, 583–589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03819-2

使用 AlphaFold2-Multimer：

Evans, R. et al. Protein complex prediction with AlphaFold-Multimer. bioRxiv (2022). https://doi.org/10.1101/2021.10.04.463034

使用 AlphaFold3：

Abramson, J. et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature 630, 493–500 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07487-w

使用 ColabFold：

Mirdita, M. et al. ColabFold: making protein folding accessible to all. Nature Methods 19, 679–682 (2022). https://doi.org/10.1038/s41592-022-01488-1

使用 AFDB 数据库中的预测结构：

Varadi, M. et al. AlphaFold Protein Structure Database: massively expanding the structural coverage of protein-sequence space with high-accuracy models. Nucleic Acids Research 50, D419–D427 (2022).

使用 Protenix：

引用 Protenix GitHub 仓库及相关技术报告（请查看仓库的最新引用指南）。

5.5 新手常见错误🔗

1. 过度信任低 pLDDT 区域的构象
2. ❌ "虽然这个 loop 的 pLDDT 只有 40，但它的构象看起来正好指向活性位点..."

3. ✅ pLDDT < 50 的区域构象基本无意义，不要基于此做分析

4. 忽略 PAE 直接对比 domain 间的距离

5. ❌ "这两个 domain 的距离是 15 Å"（但 PAE 显示两个 domain 间误差 > 20 Å）

6. ✅ 先看 PAE，如果 domain 间 PAE 很高，就不能信任它们的相对位置

7. 用 AlphaFold 预测突变效果

8. ❌ 对野生型和突变序列分别跑 AF2，比较结构差异来推断突变影响

9. ✅ AF2 对单点突变几乎不敏感（结构可能几乎一样），应使用 FoldX、Rosetta ddg、ESM 等专用工具

10. 直接用 AF2 结构做分子对接而不松弛

11. ❌ 直接将 AF2 原始输出用于 AutoDock Vina 对接

12. ✅ 先进行 Amber 松弛或短时间 MD 平衡，消除不合理的原子接触

13. 忽视同源实验结构

14. ❌ "直接用 AlphaFold 预测就好，不需要看 PDB"

15. ✅ 如果 PDB 中已有高分辨率的同源/相同蛋白质结构，实验结构始终优先于预测结构

16. 蛋白质序列输入错误

17. ❌ 包含 FASTA 头部（>protein_name）、包含非标准氨基酸字母、包含空格或换行

18. ✅ 仅输入纯氨基酸单字母编码序列，不含任何其他字符

19. 未考虑生物学组装态

20. ❌ 蛋白质在体内是四聚体，但只预测了单体结构就做分析
21. ✅ 查阅文献确定蛋白质的生理低聚态，按实际组装态预测

实操演示🔗

Demo：使用 ColabFold 预测人源血红蛋白 α 亚基结构🔗

目标蛋白： 人源血红蛋白 α 亚基（Hemoglobin subunit alpha, UniProt: P69905）

步骤：

1. 从 UniProt 获取序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P69905）
2. 打开 ColabFold Notebook
3. 输入序列：

MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSH
GSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKL
LSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR

1. 参数设置：
2. jobname: HBA_HUMAN
3. num_relax: 1
4. template_mode: none
5. num_recycles: 3

6. num_models: 5

7. 运行全部代码单元

8. 预期结果：
9. 平均 pLDDT > 90（血红蛋白 α 亚基是经典球状蛋白，结构高度确定）
10. 5 个模型结构高度一致（Cα RMSD < 0.5 Å）

11. 前几个和最后几个残基 pLDDT 可能较低（N/C 端柔性区域）

12. 在 PyMOL 中查看结果：

# PyMOL 命令
load HBA_HUMAN_relaxed_rank_001.pdb
spectrum b, red_yellow_green_cyan_blue, minimum=0, maximum=100
show cartoon
# 观察颜色分布：大部分应为深蓝色（高 pLDDT）

本章小结🔗

• ✅ AlphaFold2 在 CASP14 中取得革命性突破，能以接近实验精度预测蛋白质结构
• ✅ pLDDT、PAE、pTM 是评估预测质量的三大核心指标，务必综合使用
• ✅ ColabFold 是最推荐的入门工具——免费、快速、无需安装
• ✅ AlphaFold3 扩展到蛋白质-核酸/小分子/离子复合物预测
• ✅ 低 pLDDT（< 50）通常代表固有无序区域，不应过度解读其构象
• ✅ 实验结构始终优先于预测结构——AlphaFold 是工具，不是替代品
• ✅ 正确引用所使用的工具是基本学术规范

延伸阅读🔗

• AlphaFold2 官方 GitHub（2024-04 访问）
• AlphaFold3 官方 GitHub（2025-06 访问）
• ColabFold GitHub（2024-04 访问）
• Protenix GitHub（2025-01 访问）
• AlphaFold Protein Structure Database（2024-04 访问）
• AlphaFold Server（2024-12 访问）
• CASP 官方网站（了解竞赛历史和评估标准）
• ESMFold（不依赖 MSA 的快速结构预测替代方案）
• 相关章节：蛋白质结构预测进阶工具
• 相关章节：蛋白质设计与工程
• 相关章节：分子动力学与 AI 力场

参考文献🔗